Mechanism of Portulaca oleracea L. in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease based on data analysis
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摘要:
目的 探讨马齿苋治疗非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的分子基础与作用机制。 方法 通过TCMSP、Drug Bank、Uniprot等数据库，筛选出马齿苋的有效活性成分及其作用靶点。利用Drugbank、OMMI、GeneCards等数据库找出与NAFLD相关的基因靶点，最后取两者交集。最后利用DAVID数据库进行KEGG和GO富集分析。 结果 通过筛选得出马齿苋有10种有效成分，其中槲皮素、山奈酚、木犀草素、β-谷固醇、β-胡萝卜素是主要活性成分。共得到85个关键交集靶点，其中肿瘤坏死因子(TNF)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)、Ser/Thr蛋白激酶(AKT1)、炎症趋化因子(CCL2)为重要靶点。DAVID富集分析显示，GO功能分析主要参与调控炎症反应(P < 0.001)、细胞缺氧(P < 0.001)、凋亡(P < 0.001)、相似蛋白质结合(P < 0.001)、蛋白质二聚化活性(P < 0.001)、细胞因子活性(P < 0.001)等方面。KEGG富集分析主要与TNF(P < 0.001)、细胞凋亡(P < 0.001)、TLR(P < 0.001)、NF-κB(P < 0.001)等信号通路有关。 结论 本研究通过初步探讨马齿苋治疗NAFLD的潜在靶点和相关信号通路，为进一步深入揭示其作用机制及开发马齿苋功能性食品提供了理论依据。 Abstract:Objective To explore the molecular mechanism of Portulaca oleracea L. in the treatment of non-alcoholic fatty liver (NAFLD). Methods With the use of the TCMSP and Drug Bank and Uniprot database, the effective activity of Portulaca oleracea L. was screened out ingredients and their potential targets. The Drug bank, OMMI and GeneCards databases were used in identifying gene targets related to NAFLD and intersection targets. Finally, the DAVID database was used in conducting KEGG and GO enrichment analyses for determining the potential signal pathways of Portulaca oleracea L. for NAFLD treatment. Results Portulaca oleracea L. had 10 effective active ingredients, of which quercetin, kaempferol, luteolin, β-sitosterol and β-carotene were the main active ingredients. A total of 85 key targets were identified after matching with NAFLD gene targets, and tumor necrosis factor (TNF), cysteine aspartic protease, Ser/Thr protein kinase and inflammatory chemokines were found to be important targets. DAVID enrichment analysis showed that GO functional analysis were mainly involved in inflammation (P < 0.001), cell hypoxia (P < 0.001), and apoptosis (P < 0.001), identical protein binding (P < 0.001), protein polymerisation activity (P < 0.001) and cytokine activity (P < 0.001). KEGG enrichment analysis mainly related to TNF (P < 0.001), apoptosis (P < 0.001), TLR (P < 0.001) and NF-κB signal pathway (P < 0.001). Conclusion This study preliminarily explores the potential targets and related signal pathways of Portulaca oleracea L. in NAFLD treatment and provides a theoretical basis for further revealing mechanisms for developing the functional food of Portulaca oleracea L. -
中国人群非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)患病率为10%~30%，而且发病人数正逐年上升，导致医疗负担不断加重[1-2]。而NAFLD的发病机制较复杂，学者认为肥胖、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应、脂肪因子调节紊乱等因素对肝脏造成多重损伤[3-4]。临床上目前常用治疗药物如胰岛素增敏剂、降血脂药物在短期内有效，但是长期应用存在副作用[5]。因此寻找新型安全有效的方法防治NAFLD至关重要。
马齿苋是药食两用的植物之一，含有生物碱、黄酮、多糖等多种生物活性成分[6]，研究表明其具有抗炎、降血脂、降血糖、抗氧化、抗肿瘤、调节免疫等作用[7-9]。研究显示马齿苋能明显改善NAFLD氧化应激和炎症介导的肝脏毒性[10]。但是对于马齿苋治疗NAFLD的分子机制及其作用靶点尚不清楚。
网络药理学(network pharmacology)是揭示中药药理作用及分子机制的关键技术[11]。本研究拟对马齿苋治疗NAFLD的有效成分、作用靶点及信号通路进行探索，分析其潜在作用机制，为进一步实验及临床开发马齿苋功能性食品或药物提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 筛选马齿苋的有效活性成分
根据中药系统药理学数据库分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP)以及文献报道，以“马齿苋”为关键词，筛选出其所有化学成分[12]。再按照口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%，类药性(Drug-likeness，DL)≥0.18作为条件，进一步筛选出马齿苋中口服吸收利用度高、类药性好的有效活性成分。
1.2 马齿苋有效活性成分的靶点预测
针对上述筛选出的有效活性成分，在TCMSP平台找出其作用靶点。利用蛋白质资源数据库Uniprot(http://www.uniprot.org/)，将蛋白靶点转换成对应的基因名称。
1.3 检索NAFLD相关基因靶点
将“NAFLD”“Non-alcoholic fatty liver disease”作为检索词，分别在人类基因组数据库GeneCards(http://www.genecards.org/)，DrugBank(https://www.drugbank.ca/)，孟德尔遗传数据库OMIM(http://www.omim.org/)进行检索，查找所有与NAFLD相关的基因靶点。
1.4 构建蛋白质-蛋白质相互作用PPI(protein-protein interaction)网络图
将马齿苋有效活性成分对应的作用靶点与疾病相关基因靶点取交集，再将其导入到STRING(https://string-db.org/)和Metascape(http://metascape.org/)数据库，进行蛋白相互作用分析，构建出PPI网络图。
1.5 靶点通路富集分析
通过DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库富集分析上述获得的交集靶点，设定物种为“人类(homo sapiens)”，导入上述所有交集基因靶点，最终富集分析GO和KEGG信号通路，挖掘基因或蛋白的生物学意义。
1.6 统计学方法
采用DAVID数据库进行GO和KEGG富集分析，计数资料以率(%)表示，比较采用Fisher精确检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。
2. 结果
2.1 马齿苋的有效活性成分
根据TCMSP平台收集到马齿苋有效活性成分10种，分别为花生四烯酸、环烯醇、β-胡萝卜素、β-谷固醇、山奈酚、5, 7-二羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)苯并四氢吡喃-4-酮、木犀草素、异黄烷素、异单宁_qt、槲皮素，见表 1。
表 1 马齿苋的10种有效活性成分分子ID 英文名 中文名 分子量 OB值(%) DL值 MOL001439 arachidonic acid 花生四烯酸 304.52 45.57 0.2 MOL003578 Cycloartenol 环烯醇 426.80 38.69 0.78 MOL002773 beta-carotene β-胡萝卜素 536.96 37.18 0.58 MOL000358 beta-sitosterol β-谷固醇 414.79 36.91 0.75 MOL000422 kaempferol 山奈酚 286.25 41.88 0.24 MOL005100 5, 7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one 5, 7-二羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)苯并四氢吡喃-4-酮 302.30 47.74 0.27 MOL000006 luteolin 木犀草素 286.25 36.16 0.25 MOL006657 isobetanidin 异黄烷素 388.36 59.73 0.52 MOL006662 isobetanin_qt 异单宁_qt 388.36 30.16 0.52 MOL000098 quercetin 槲皮素 302.25 46.43 0.28 2.2 马齿苋活性成分的潜在作用靶点预测
马齿苋活性成分的潜在靶点共220个。槲皮素对应的潜在靶点有154个，靶点最多，其次为山奈酚有63个潜在靶点，木犀草素有57个潜在靶点。一种活性成分对应多个基因靶点，如槲皮素对应PPARG，MAPK1，IL1B，IL6等；不同活性成分也可对应相同靶点，如槲皮素、山奈酚、木犀草素均对应TNF，MMP1，INSR等基因靶点。
2.3 马齿苋活性成分与NAFLD的交集靶点
通过数据库检索共获得目前与NAFLD密切相关的靶点基因有1 051个，将其与活性成分对应靶点(220个)取交集，共得到85个靶点。表明这85个靶点可能是马齿苋治疗NAFLD的关键靶点。
2.4 马齿苋活性成分与NAFLD交集靶点的PPI网络图
根据STRING和Metascape分析得出，马齿苋活性成分与NAFLD交集基因靶点的蛋白质相互作用主要为肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子受体(TNF-TNFR)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)、Ser/Thr蛋白激酶(AKT1)、炎症趋化因子(CCL2)等，见图 1~2。
2.5 GO和KEGG富集分析
DAVID数据库结果显示，GO功能分析479个条目具有统计学意义，包括生物过程(BP)377个，主要参与调控炎症反应(C=21，P < 0.001)、细胞缺氧反应(C=13，P < 0.001)、细胞凋亡(C=21，P < 0.001)等；分子功能(CC)36个，主要涉及细胞外空间(C=37，P < 0.001)、胞质溶胶(C=36，P < 0.001)等；细胞组成(MF)66个，主要涉及相同的蛋白质结合(C=22，P < 0.001)、蛋白质二聚化活性(C=20，P < 0.001)、细胞因子活性(C=9，P < 0.001)等方面，见表 2。
表 2 马齿苋治疗NAFLD潜在靶点的GO功能分析GO分析 ID 条目 靶点数 P值 生物过程(BP) 0006954 炎症反应 21 < 0.001 0071456 细胞缺氧反应 13 < 0.001 0043066 凋亡负调控 21 < 0.001 分子功能(CC) 0005615 细胞外空间 37 < 0.001 0005829 胞质溶胶 36 < 0.001 0009897 质膜外侧 10 < 0.001 细胞组成(MF) 0042802 相同的蛋白质结合 22 < 0.001 0042803 蛋白质均二聚活性 20 < 0.001 0005125 细胞因子活性 9 < 0.001 KEGG富集分析得到58条具有统计学意义，主要参与调控TNF信号通路(C=20，P < 0.001)、细胞凋亡信号通路(C=12，P < 0.001)、TLR信号通路(C=14，P < 0.001)、NF-κB信号通路(C=13，P < 0.001)等，见表 3。
表 3 马齿苋治疗NAFLD相关信号通路的KEGG分析ID 条目 靶点数 P值 hsa04668 TNF信号通路 20 < 0.001 hsa05200 癌症通路 31 < 0.001 hsa04932 非酒精性脂肪肝病(NAFLD) 19 < 0.001 hsa04210 细胞凋亡 12 < 0.001 hsa04620 TLR信号通路 14 < 0.001 hsa04064 NF-κB信号通路 13 < 0.001 3. 讨论
本研究通过寻找马齿苋的有效活性成分，结合药理及信息学手段，从分子水平分析治疗NAFLD的作用靶点及相关信号通路。结果显示，马齿苋的有效活性成分主要为黄酮类物质如槲皮素、山奈酚、木犀草素，还有萜类物质β-谷固醇、β-胡萝卜素，以及多不饱和脂肪酸花生四烯酸等。马齿苋活性成分-靶点预测分析结果显示，槲皮素和山奈酚的靶点最多，花生四烯酸、β-谷固醇、β-胡萝卜素对应的靶点也较多，提示这几种成分很可能是马齿苋发挥作用的主要成分。还可以看出一种成分可对应多个靶点，不同的活性成分也可对应同一靶点，表明马齿苋是以多成分、多靶点的方式共同发挥作用。既往已有研究表明，槲皮素有抗氧化、抗炎、降血脂等作用。马齿苋中生物碱可以通过抑制LPS诱导小鼠单核巨噬细胞NO的产生发挥抗炎作用。马齿苋中的黄酮类物质具有抗氧化作用，能预防糖尿病、冠状动脉粥样硬化等疾病[13-14]。槲皮素对高脂饮食诱导的NAFLD大鼠有治疗作用，其机制与SCD1表达增加和LXR-α表达降低有关[15]。槲皮素可以改善胰岛素抵抗，对非酒精性脂肪肝病有治疗作用[16]。山奈酚具有抗炎、抗凋亡、抗氧化等多种生物学活性[17]。木犀草素和番茄红素结合可以通过激活Sirt1/AMPK信号通路有效改善NAFLD中的“两次打击”[18]。药物与靶点的网络关系复杂，马齿苋治疗NAFLD的机制值得进一步探索。
本研究结果显示，马齿苋与NAFLD交集基因主要为TNF-TNFR、CASP、AKT1、CCL2等，这些基因参与调控TNF信号通路、细胞凋亡、TLR信号通路、NF-κB信号通路等。这一结果提示马齿苋具有多靶点-多通路治疗NAFLD的重要特点。目前研究[19]认为NAFLD发病机制主要涉及“多重打击”学说，多种因素共同导致脂代谢异常、胰岛素抵抗、脂肪细胞功能障碍、炎症、纤维化、细胞凋亡在内的肝脏病变。GO富集分析结果表明，马齿苋的有效活性成分广泛涉及炎症反应、细胞缺氧反应、凋亡、细胞外区域、蛋白质结合、蛋白质二聚化活性、细胞因子活性等生物学过程。KEGG富集分析显示，马齿苋治疗NAFLD代谢通路有58条，表明马齿苋的关键活性成分是参与调控TNF、细胞凋亡、TLR、NF-κB等多条信号通路发挥治疗NAFLD的作用。这些证据表明马齿苋活性成分-疾病的调控机制存在复杂且相互交叉的关系。
综上所述，本研究应用网络药理学方法初步分析了马齿苋治疗NAFLD的主要活性成分及相关信号通路，为今后开发药食两用植物马齿苋成为抗NAFLD功能性食品或临床应用提供依据。
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表 1 马齿苋的10种有效活性成分
分子ID 英文名 中文名 分子量 OB值(%) DL值 MOL001439 arachidonic acid 花生四烯酸 304.52 45.57 0.2 MOL003578 Cycloartenol 环烯醇 426.80 38.69 0.78 MOL002773 beta-carotene β-胡萝卜素 536.96 37.18 0.58 MOL000358 beta-sitosterol β-谷固醇 414.79 36.91 0.75 MOL000422 kaempferol 山奈酚 286.25 41.88 0.24 MOL005100 5, 7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one 5, 7-二羟基-2-(3-羟基-4-甲氧基苯基)苯并四氢吡喃-4-酮 302.30 47.74 0.27 MOL000006 luteolin 木犀草素 286.25 36.16 0.25 MOL006657 isobetanidin 异黄烷素 388.36 59.73 0.52 MOL006662 isobetanin_qt 异单宁_qt 388.36 30.16 0.52 MOL000098 quercetin 槲皮素 302.25 46.43 0.28 
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表 2 马齿苋治疗NAFLD潜在靶点的GO功能分析
GO分析 ID 条目 靶点数 P值 生物过程(BP) 0006954 炎症反应 21 < 0.001 0071456 细胞缺氧反应 13 < 0.001 0043066 凋亡负调控 21 < 0.001 分子功能(CC) 0005615 细胞外空间 37 < 0.001 0005829 胞质溶胶 36 < 0.001 0009897 质膜外侧 10 < 0.001 细胞组成(MF) 0042802 相同的蛋白质结合 22 < 0.001 0042803 蛋白质均二聚活性 20 < 0.001 0005125 细胞因子活性 9 < 0.001
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表 3 马齿苋治疗NAFLD相关信号通路的KEGG分析
ID 条目 靶点数 P值 hsa04668 TNF信号通路 20 < 0.001 hsa05200 癌症通路 31 < 0.001 hsa04932 非酒精性脂肪肝病(NAFLD) 19 < 0.001 hsa04210 细胞凋亡 12 < 0.001 hsa04620 TLR信号通路 14 < 0.001 hsa04064 NF-κB信号通路 13 < 0.001
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