Effect of platelet-rich plasma combined with sodium hyaluronate in the treatment of knee osteoarthritis
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摘要:
目的 探讨注射富血小板血浆、透明质酸钠治疗膝骨关节炎(KOA)患者的效果。 方法 选取河南科技大学第一附属医院2018年6月—2020年2月收治的120例KOA患者，采用随机数字表进行分组，其中60例患者接受基础治疗+膝关节注射透明质酸钠(常规组)，另外60例在常规组治疗基础上使用富血小板血浆治疗(研究组)；对比治疗前后膝关节液中调节复合因子1α(ASF1α) mRNA、软骨细胞中沉默信息调节因子1(SIRT1) mRNA的变化及相关指标差异。 结果 治疗后研究组的膝关节肿胀评分为(1.83±0.51)分、疼痛程度评分为(2.87±0.98)分，均低于常规组的(2.28±0.65)分、(3.31±1.20)分，差异有统计学意义(均P＜0.05)；治疗后研究组的ASF1α mRNA表达强度为0.58±0.17，低于常规组的0.71±0.21(P＜0.05)，研究组的SIRT1 mRNA表达为1.41±0.30、超氧化物歧化酶(SOD)为(124.9±28.0)U/L，高于常规组的1.22±0.28、(113.8±24.1)U/L(均P＜0.05)；治疗后研究组的Lysholm评分为(69.84±11.03)分，高于常规组的(65.28±12.26)分(P＜0.05)；研究组的治疗总有效率为98.33%，高于常规组的85.00%(P＜0.05)。 结论 注射富血小板血浆、透明质酸钠治疗KOA患者能有效调节关节液中ASF1α mRNA、SIRT1 mRNA、SOD水平，对于关节功能恢复、临床症状缓解具有显著作用。 Abstract:Objective To investigate the effect of injection of platelet-rich plasma and sodium hyaluronate on knee osteoarthritis (KOA). Methods A total of 120 patients admitted in the First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology from June 2018 to February 2020 was selected. The random number table was used to group patients: 60 patients with foundation treatment + knee joint injection of sodium hyaluronate (conventional group) comprised one group, and 60 patients with use of platelet rich plasma treatment on the basis of routine treatment group (study group) comprised the other group. The changes in regulatory complex factor 1α mRNA and silencing information regulator 1 in chondrocytes mRNA in knee joint fluid and other factors were compared before and after treatment. Results After treatment, the knee swelling score of the study group was (1.83±0.51) points and the pain score of the study group was (2.87±0.98) points, which were lower than those of the conventional group (2.28±0.65) points and (3.31±1.20) points; the differences were statistically significant (all P < 0.05). After treatment, the mRNA expression intensity of ASF1α in the study group was 0.58±0.17, which was lower than that in the conventional group (0.71±0.21, P < 0.05). The mRNA expression levels of SIRT1 and superoxide dismutase in the study group were 1.41±0.30 and (124.9±28.0) U/L, respectively, which were higher than those in the conventional group [1.22±0.28 and (113.8±24.1) U/L, all P < 0.05]. After treatment, the Lysholm score of the study group was (69.84±11.03) points, which was higher than that of the conventional group [(65.28±12.26) points, P < 0.05]. The total effective rate of the study group was 98.33%, which was higher than 85.00% of the conventional group (P < 0.05). Conclusion Injection of platelet-rich plasma and sodium hyaluronate in KOA patients can effectively regulate the levels of ASF1α mRNA, SIRT1 mRNA and SOD in the joint fluid, and it has a significant effect on the recovery of joint function and relief of clinical symptoms. -
膝骨关节炎(knee osteoarthritis，KOA)是一种慢性、退行性膝关节疾病，病理特征为关节软骨功能退变、剥脱、骨质增生和滑膜炎，患者临床表现为膝关节疼痛、肿胀和功能障碍等[1]。临床常用治疗方法为保守治疗，包括非甾体类抗炎药、物理疗法和体重控制等[2]。但是，由于关节软骨的再生和修复能力较弱，治疗效果不佳。KOA治疗的主要目的是减轻膝关节疼痛并改善膝关节功能[3]。透明质酸钠主要用于KOA的临床治疗，取得了良好的效果[4]，但持久性上存在一定争议。富血小板血浆(platelet-rich plasma，PRP)是通过离心从自体血液中提取的血小板浓缩液，富含生长因子和炎性调节剂，可以促进软组织和骨组织的修复，而不会产生免疫排斥，目前被广泛关注[5]。为了探讨注射富血小板血浆、透明质酸钠治疗KOA患者的效果及对关节液中软骨细胞中沉默信息调节因子1(silencing information regulator 1 in chondrocytes，SIRT1)、调节复合因子1α(regulatory complex factor 1α，ASF1α)表达的影响，本研究对KOA患者进行临床治疗比较，现报道如下。
1. 资料与方法
1.1 临床资料
选取河南科技大学第一附属医院2018年6月—2020年2月收治的KOA患者120例, 采用随机数字表法进行分组，其中60例患者接受基础治疗+膝关节注射透明质酸钠(常规组)，另外60例在常规组治疗基础上使用富血小板血浆治疗(研究组)。纳入标准：(1)患者的主要临床表现为膝关节的疼痛、畸形、功能障碍，诊断标准参考美国风湿病学会《膝关节骨性关节炎诊断标准》[6]；(2)年龄为40~75岁；(3)X线进行膝关节检查发现关节边缘骨赘生物增生；(4)Kellgren-Lawrence(K-L)[7]分级Ⅰ~Ⅲ级。排除标准：(1)近2个月使用非甾体类抗炎药；(2)其他疾病引起的膝关节炎(痛风性关节炎、化脓性关节炎等)；(3)精神病、阿尔茨海默病；(4)系统性红斑狼疮等；(5)其他类型疾病导致的膝关节畸形、肌肉萎缩等。
研究组年龄为40~75岁，其中男性21例，女性39例。常规组年龄为43~75岁，其中男性24例，女性36例。2组年龄、性别等一般资料比较，差异无统计学意义(均P>0.05), 详见表 1。患者知情且愿意配合完成本研究，研究方案经院医学伦理委员会批准。
表 1 2组KOA患者一般资料比较Table 1. Comparison of general data of two groups of KOA patients组别 例数 年龄(x±s，岁) BMI 病程(x±s，年) 性别[例(%)] 高血压[例(%)] 糖尿病[例(%)] 患侧分布[例(%)] 男性 女性 是 否 是 否 左侧 右侧 研究组 60 60.5±8.3 23.1±2.4 6.2±1.7 21(35.00) 39(65.00) 13(21.67) 47(78.33) 7(11.67) 53(88.33) 32(53.33) 28(46.67) 常规组 60 61.7±7.9 23.4±2.2 5.9±2.0 24(40.00) 36(60.00) 8(13.33) 52(86.67) 3(5.00) 57(95.00) 27(45.00) 33(55.00) 统计量 0.811a 0.714a 0.885a 0.320b 1.443b 1.745b 0.834b P值 0.419 0.477 0.378 0.572 0.230 0.186 0.361 注：a为t值，b为χ2值。 1.2 治疗方法
常规组：基础治疗+膝关节注射透明质酸钠。患者仰卧位，垫高膝盖，使用注射器吸取5 mL生理盐水和2 mL利多卡因选择髌骨的1/3位置穿刺，如果关节腔中积液较多，可以先吸出部分积液然后关节腔内注射20 mg透明质酸钠；选择内侧和外侧副韧带、脂肪垫、鹅足滑囊等处总共有5个疼痛点，注入2.5 mL透明质酸钠(山东博士伦古瑞达制药有限公司；国家医药标准20181208)，拔出针头，按压5 min，并用无菌敷料保护。
研究组在常规组治疗基础上使用富血小板血浆治疗。患侧肘部抽取40 mL血液，并将其注入预先装有柠檬酸钠抗凝剂的离心管中，以3 000 r/min的速度离心10 min，离心半径为4 cm，全血分为三层，上层为上清液下层红细胞，两层交界处的浅黄色层是PRP层，除去上清液的上层和红细胞的下层，并从边界层提取富含血小板的血浆。患者仰卧位，髌骨外1/3作为穿刺点，注射器将5 mL生理盐水和2 mL利多卡因进行穿刺。有突破感后回抽关节液确定针尖是否到达关节腔内，然后向关节腔中注入约2 mL富血小板血浆；选择内侧和外侧副韧带、脂肪垫、鹅足滑囊等处总共有5个疼痛点，在每个点上注入约0.2 mL的PRP，拔出针头，按压5 min，并用无菌敷料保护。
2组治疗后协助患者缓慢屈伸膝关节数次，用厚棉垫和弹性绷带包扎，并提示患者术后48 h内避免在穿刺部位淋水。
1.3 观察指标及检测方法
1.3.1 膝关节功能评价
对比2组治疗前及治疗2周后的膝关节功能。膝关节功能评分采用Lysholm评分量表[8]评价，跛行总分5分、支持总分5分、绞锁总分15分、不稳定总分25分、肿胀总分10分、上楼总分10分、下蹲总分5分、疼痛总分25分。量表总分为100分，分值越高患者的膝关节功能恢复越好。
1.3.2 肿胀程度、疼痛程度评价
肿胀程度：膝关节无肿胀(1分)；膝关节轻度发肿，皮纹变浅(2分)；膝关节的肿胀比较明显，不可见皮纹，患者的骨性标记消失(3分)；膝关节的肿胀非常明显，肉眼可见关节处皮肤处于紧绷状态(4分)。
疼痛程度：采用视觉模拟疼痛评分法(VAS)[9]进行评价，依据患者对于疼痛的主观感受进行评价，最高10分、最低0分，疼痛程度与评分呈正比。
1.3.3 临床疗效
依据患者的Lysholm评分结果划分，临床控制：患者的Lysholm评分≥80分；治疗有效：患者的Lysholm评分达到60~79分；无效：治疗后患者的Lysholm评分＜60分。
1.3.4 膝关节液中实验室指标检测
比较膝关节液中ASF1α mRNA、SIRT1 mRNA、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的表达差异。实时荧光定量PCR检测入院时和治疗后次日各组血清和滑液中ASF1α mRNA和SIRT1 mRNA的表达。在治疗前后清晨空腹抽取2 mL静脉血，并以2 000 r/min的速度离心10 min，离心半径为4 cm，取上清液。关节液收集：在常规消毒前后，取出1 mL膝关节滑液，沉淀处理后置于-80 ℃下。ASF1α mRNA、SIRT1 mRNA检测引物信息如下，ASF1α，F：5’-CAGATGCAGATGCAGTAGGC-3’；R：5’-CCTGGGATTAGATGCCAAAA-3’，236 bp；SIRT1，F：5’-GCCTCAT5’-GCCTCTGCATT-TTGATG-GCATGTCCCACTATCA-3’，294 bp；GAPDG，F：5’-CAGGGTGCTTTTAAC TCTGGT；R：5’-GATTTTGGAGGGATCTCG CT-3’，258 bp。
在治疗前后，取膝关节液后进行沉淀处理，提取总RNA并反转录。将11 μL cDNA模板和0.5 μL上游和下游引物添加到赛博绿PCR反应液中(10 μL)中，PCR循环在反应溶液(10 μL)进行，95 ℃(10 min)，60 ℃(20 s)，72 ℃(30 s)，4 ℃(5 min)。每个基因样本与3个孔平行进行测试。用2-ΔΔCT法分析实验结果。在治疗前后测定关节液SOD活性和MDA含量，进行关节腔穿刺从关节腔中提取滑液，并用化学比色法检测滑液中SOD活性和MDA含量，试剂盒购于北京凯诺春田生物技术有限公司。
1.4 统计学方法
使用SPSS 21.0统计学软件处理数据。计量资料采用x±s表示，组间比较采用成组t检验，组内治疗前后比较采用配对t检验；计数资料以例(%)表示，组间比较用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 2组患者膝关节肿胀、疼痛程度评分比较
治疗前2组患者的膝关节肿胀、疼痛程度评分比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；治疗后，研究组的膝关节肿胀、疼痛程度评分均低于常规组，差异有统计学意义(均P＜0.05)，见表 2。
表 2 2组膝骨关节炎患者膝关节肿胀、疼痛程度评分比较(x±s，分)Table 2. Comparison of knee swelling and pain scores between two groups of knee osteoarthritis patients (x±s, points)组别 例数 肿胀评分 VAS评分 治疗前 治疗2周后 治疗前 治疗2周后 研究组 60 3.06±0.77 1.83±0.51a 6.39±1.83 2.87±0.98a 常规组 60 3.21±0.94 2.28±0.65a 6.14±1.77 3.31±1.20a t值 0.956 4.219 0.761 -2.200 P值 0.341 ＜0.001 0.448 0.030 注：与同组治疗前比较，aP＜0.05。 2.2 2组患者治疗前后的实验室指标比较
治疗前2组患者膝关节液中ASF1α mRNA、SIRT1 mRNA、MDA、SOD比较，差异均无统计学意义(均P>0.05)；治疗2周后，研究组的ASF1α mRNA低于常规组(P＜0.05)，SIRT1 mRNA、SOD高于常规组(均P＜0.05)，见表 3。
表 3 2组膝骨关节炎患者治疗前后的实验室指标比较(x±s)Table 3. Comparison of laboratory indexes of knee osteoarthritis patients before and after treatment between 2 groups (x±s)组别 例数 ASF1α mRNA SIRT1 mRNA MDA(μmol/L) SOD(U/L) 治疗前 治疗2周后 治疗前 治疗2周后 治疗前 治疗2周后 治疗前 治疗2周后 研究组 60 1.04±0.22 0.58±0.17a 0.89±0.32 1.41±0.30a 8.53±1.77 4.40±1.18a 87.70±16.40 124.90±28.00a 常规组 60 0.98±0.24 0.71±0.21a 0.94±0.30 1.22±0.28a 8.18±1.83 4.78±1.23a 90.60±18.00 113.80±24.10a t值 1.427 3.727 0.883 3.586 1.065 1.727 0.922 2.327 P值 0.156 ＜0.001 0.379 ＜0.001 0.289 0.087 0.358 0.022 注：与同组治疗前比较，aP＜0.05。 2.3 2组患者治疗前后的膝关节功能评分比较
治疗前2组患者的Lysholm评分比较，差异无统计学意义(P>0.05)；治疗后研究组的Lysholm评分高于常规组(P＜0.05)，见表 4。
表 4 2组膝骨关节炎患者治疗前后Lysholm评分比较(x±s，分)Table 4. Comparison of Lysholm score before and after treatment between 2 groups of knee osteoarthritis patients组别 例数 治疗前 治疗2周后 t值 P值 研究组 60 47.18±9.63 69.84±11.03 11.192 ＜0.001 常规组 60 49.60±10.32 65.28±12.26 6.150 ＜0.001 t值 1.328 2.142 P值 0.187 0.034 2.4 2组患者治疗后的膝关节功能比较
治疗2周后，研究组的治疗总有效率为98.33%，高于常规组的85.00%(P＜0.05)，见表 5。
表 5 2组膝骨关节炎患者治疗后的膝关节功能比较Table 5. Comparison of knee function between two groups of patients with knee osteoarthritis after treatment组别 例数 临床控制(例) 有效(例) 无效(例) 总有效[例(%)] 研究组 60 26 33 1 59(98.33) 常规组 60 10 41 9 51(85.00) 注：2组总有效率比较，连续校正χ2=5.345，P=0.021。 3. 讨论
KOA也被称为老年性膝关节炎，以老年患者多发，是一种基于各种病因引起的退行性病理变化的疾病。由于膝关节愈合能力弱，KOA容易引起膝关节软骨变性并伴有骨质增生、软骨剥离等，进一步导致膝关节疼痛，严重者导致膝关节功能障碍[10]。KOA引起大量膝关节积液积聚，导致患者疼痛加剧以及患肢的伸展和屈曲困难。KOA当前治疗方法主要是药物关节内注射。当其他药理学干预失败时，将各种药物注入膝关节可以有效减轻疼痛并增强关节功能。近年来以PRP和透明质酸钠液的使用研究较多[11-12]。
KOA的早期病理变化以软骨损伤为主，其次是关节生物力线失衡，引起继发性软组织损伤，疼痛进一步损害软骨形成一系列恶性循环[13]。修复软骨是打破恶性循环链的最关键步骤。PRP富含血小板、纤维蛋白和少量白细胞，活化后血小板释放多种生长因子，可促进软骨细胞的增殖和分裂，并促进软骨修复，纤维蛋白为软骨修复提供了良好的三维环境，有利于生长因子的分泌和组织修复[14-16]。本研究显示，研究组治疗后的膝关节肿胀、疼痛程度评分均明显低于常规组，Lysholm评分、治疗总有效率高于常规组，说明向关节腔内注入PRP在缓解疼痛、提高治疗效果方面优于透明质酸钠。分析其原因是向关节腔内注入透明质酸钠可以补充内源性滑液，减轻滑膜组织的炎症反应，保护软骨功能，有效抑制疾病的进一步发展，但不能从根本上解决软骨退变。与透明质酸钠相比，PRP在改善关节功能和减轻疼痛方面具有更持久的作用，其可以修复关节软骨、重建关节表面和关节功能，并防止进一步的关节退变。因此，PRP组患者的症状有效缓解并且可以维持较长时间，因为透明质酸钠没有修复软骨损伤的作用，持续作用时间较短。
研究表明[17-18]，由氧化应激产生的氧自由基也与KOA的发生发展密切相关，KOA患者血清中的MDA、SOD活性改变代表氧化应激与骨关节炎的发病机制有关。本研究结果显示治疗后实验组SOD水平显著高于正常值，证实上述氧化应激反应与KOA的发生有关。有证据表明[19]KOA软骨细胞中SIRT1的表达水平显著降低，主要是因为患者软骨细胞的分化表型和存活能力受影响，软骨基质成分的表达异常。ASF1α是一种衰老的分子伴侣蛋白，可以触发各种衰老指示剂的出现，并可以引发与衰老相关的异染色体聚集[20-21]。本研究结果显示，治疗后，研究组的ASF1α mRNA明显低于常规组，SIRT1 mRNA明显高于常规组。分析原因是关节腔内外注射PRP可以减少KOA患者软骨细胞的炎症，促进软骨胶原蛋白的合成，减少破骨细胞因子的分泌，增强软骨细胞的再生能力，降低降解速率，减少膝关节软骨细胞的损伤和凋亡，关节腔中没有过多的死细胞渗漏蛋白和mRNA表达，从而导致滑液中ASF1α和SIRT1 mRNA的下降趋势。血清抗衰老因子SIRT1 mRNA的升高和衰老伴侣蛋白ASF1α mRNA的降低与KOA患者的临床症状趋势相同，表明关节腔内注射PRP可调节衰老/抗衰老平衡，从而减少了KOA患者的膝关节软骨细胞的凋亡和死亡，促进了软骨的合成，从而达到治疗KOA的目的。
本研究结果表明2种治疗KOA的方法在改善临床疼痛症状和膝关节功能方面都有良好的效果，关节腔内注射PRP治疗的中长期效果优于关节内注射透明质酸钠治疗。但研究也有一定的局限性，样本量少，没有观察和随访等，因此仍然需要更深入的研究。
综上所述，注射富血小板血浆、透明质酸钠治疗KOA患者能有效调节关节液中ASF1α mRNA、SIRT1 mRNA、SOD水平，对于关节功能恢复、临床症状缓解具有显著作用。
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表 1 2组KOA患者一般资料比较
Table 1. Comparison of general data of two groups of KOA patients
组别 例数 年龄(x±s，岁) BMI 病程(x±s，年) 性别[例(%)] 高血压[例(%)] 糖尿病[例(%)] 患侧分布[例(%)] 男性 女性 是 否 是 否 左侧 右侧 研究组 60 60.5±8.3 23.1±2.4 6.2±1.7 21(35.00) 39(65.00) 13(21.67) 47(78.33) 7(11.67) 53(88.33) 32(53.33) 28(46.67) 常规组 60 61.7±7.9 23.4±2.2 5.9±2.0 24(40.00) 36(60.00) 8(13.33) 52(86.67) 3(5.00) 57(95.00) 27(45.00) 33(55.00) 统计量 0.811a 0.714a 0.885a 0.320b 1.443b 1.745b 0.834b P值 0.419 0.477 0.378 0.572 0.230 0.186 0.361 注：a为t值，b为χ2值。 
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表 2 2组膝骨关节炎患者膝关节肿胀、疼痛程度评分比较(x±s，分)
Table 2. Comparison of knee swelling and pain scores between two groups of knee osteoarthritis patients (x±s, points)
组别 例数 肿胀评分 VAS评分 治疗前 治疗2周后 治疗前 治疗2周后 研究组 60 3.06±0.77 1.83±0.51a 6.39±1.83 2.87±0.98a 常规组 60 3.21±0.94 2.28±0.65a 6.14±1.77 3.31±1.20a t值 0.956 4.219 0.761 -2.200 P值 0.341 ＜0.001 0.448 0.030 注：与同组治疗前比较，aP＜0.05。
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表 3 2组膝骨关节炎患者治疗前后的实验室指标比较(x±s)
Table 3. Comparison of laboratory indexes of knee osteoarthritis patients before and after treatment between 2 groups (x±s)
组别 例数 ASF1α mRNA SIRT1 mRNA MDA(μmol/L) SOD(U/L) 治疗前 治疗2周后 治疗前 治疗2周后 治疗前 治疗2周后 治疗前 治疗2周后 研究组 60 1.04±0.22 0.58±0.17a 0.89±0.32 1.41±0.30a 8.53±1.77 4.40±1.18a 87.70±16.40 124.90±28.00a 常规组 60 0.98±0.24 0.71±0.21a 0.94±0.30 1.22±0.28a 8.18±1.83 4.78±1.23a 90.60±18.00 113.80±24.10a t值 1.427 3.727 0.883 3.586 1.065 1.727 0.922 2.327 P值 0.156 ＜0.001 0.379 ＜0.001 0.289 0.087 0.358 0.022 注：与同组治疗前比较，aP＜0.05。
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表 4 2组膝骨关节炎患者治疗前后Lysholm评分比较(x±s，分)
Table 4. Comparison of Lysholm score before and after treatment between 2 groups of knee osteoarthritis patients
组别 例数 治疗前 治疗2周后 t值 P值 研究组 60 47.18±9.63 69.84±11.03 11.192 ＜0.001 常规组 60 49.60±10.32 65.28±12.26 6.150 ＜0.001 t值 1.328 2.142 P值 0.187 0.034
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表 5 2组膝骨关节炎患者治疗后的膝关节功能比较
Table 5. Comparison of knee function between two groups of patients with knee osteoarthritis after treatment
组别 例数 临床控制(例) 有效(例) 无效(例) 总有效[例(%)] 研究组 60 26 33 1 59(98.33) 常规组 60 10 41 9 51(85.00) 注：2组总有效率比较，连续校正χ2=5.345，P=0.021。
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