近年来胶质瘤研究取得了较大进展，但仍然缺乏有效及特异的胶质瘤诊断标记物，且胶质瘤治疗上依然没有显著突破，治疗效果及手段仍然有限，复发后更加难以控制。胶质瘤的发生过程可能包含细胞内多种信号通路的协同改变，是一种多基因疾病^[1-3]。

为更好地了解胶质瘤发生发展的机制，课题组在肿瘤实体组织比较蛋白质组学研究的基础上^[4]，筛选出膜联蛋白A1(annexin A1，ANXA1)和S100A16蛋白作为胶质瘤组织蛋白质标记物的验证对象，采用免疫组织化学方法检测胶质瘤组织中ANXA1和S100A16的表达情况，分析这2种蛋白质在胶质瘤临床分期和预后中的意义，为胶质瘤的诊断、鉴别诊断、临床分期和预后判断寻找新的生物学标记物。

1.   资料与方法

1.1   临床资料

所有病理标本取自2015年1月—2020年12月广东祈福医院和南部战区总医院确诊的胶质瘤初诊患者，共160例，以肿瘤旁正常脑组织作为正常对照组。根据2016年WHO胶质瘤诊断标准进行分级，WHO Ⅰ级胶质瘤40例：包含毛细胞型星形细胞瘤34例、毛黏液样型星形细胞瘤4例、室管膜下巨细胞星形细胞瘤2例；WHO Ⅱ级胶质瘤40例：包含弥漫性星形细胞瘤23例、少突胶质细胞瘤12例、混合型少突-星形细胞瘤5例；WHO Ⅲ级胶质瘤40例：包含间变性星形细胞瘤32例、间变性少突胶质细胞瘤8例；WHO Ⅳ级胶质瘤40例：包含星形细胞瘤来源的胶质母细胞瘤25例、少突胶质细胞来源的胶质母细胞瘤15例。其中，不包含WHO Ⅰ级的星形细胞来源的肿瘤共80例，少突胶质细胞瘤35例，混合型少突-星形细胞瘤5例。同时根据2016年WHO胶质瘤诊断标准简单分为低级别胶质瘤(WHO Ⅰ级和WHO Ⅱ级)和高级别胶质瘤(WHO Ⅲ级和WHO Ⅳ级)，各80例。另选取胚胎发育不良性神经上皮肿瘤(dysembryoplastic neuroepithelial tumor, DNT)20例。所有病例中男性111例，女性69例，年龄为21~78岁，中位年龄为58岁。所有病例均为初诊患者，均无严重并发症、无基础性代谢性疾病，术前未行放化疗及靶向治疗，常规病理取材，10%中性缓冲福尔马林固定液固定6~8 h，常规脱水处理及石蜡切片，所选取蜡块均包含肿瘤旁正常脑组织。本研究通过广东祈福医院伦理委员会批准。

1.2   研究方法

免疫组化采用SP法。免疫组化试剂ANXA1和S100A16均购自Abcam公司，均为兔抗人多克隆抗体，工作浓度均为1∶ 50，检测方法严格按照试剂盒所附操作说明书的步骤进行。所选蜡块以4 μm厚度常规切片，涂胶片捞片，脱蜡，微波抗原修复12 min，充分水洗，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，滴加山羊血清封闭，室温孵育30 min；甩去多余液体，随后加入ANXA1一抗和S100A16一抗4 ℃孵育2 h；PBS洗；滴加通用型生物素标记二抗，37 ℃孵育40 min；二氨基联苯胺显色30 s，苏木素染液复染，乙醇脱水、透明、中性树胶封固。采用已知阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3   免疫组化结果判读

2个抗体均以胞核或胞质出现棕黄色颗粒着色为阳性细胞。采用二级记分法判定结果，阳性细胞数<5%为0分；5%~25%为1分；26%~50%为2分；51%~75%为3分；>75%为4分。染色强度分类：淡黄色为1分；黄色或深黄色为2分；褐色或棕黄色为3分。两者相加 < 2分为阴性(-)；2~3分为阳性(+)；4~5分为中等阳性(++)；6~7分为强阳性(+++)。

1.4   统计学方法

使用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。计数资料采用例(%)表示，组间比较采用χ²检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2.   结果

2.1   ANXA1和S100A16在胶质瘤中的表达

免疫组织化学染色结果显示ANXA1主要表达于胶质瘤细胞胞质，胞膜也有表达，胶质瘤组阳性率为80.6%(129/160)，正常脑组织阳性率为7.5%(12/160)，两者差异有统计学意义。S100A16则表达于肿瘤细胞胞浆和胞核，弥漫分布，胶质瘤组阳性率为86.3%(138/160)，也显著高于正常对照组10.0%(19/160)，见图 1、表 1~2。

图  1  胶质瘤组织中ANXA1和S100A16的阳性表达(SP法，×200)

注：A为胶质瘤细胞ANXA1的阳性表达状态，呈胞质及胞膜弥漫阳性；B为S100A16的阳性表达状态，呈胞质及胞核弥漫阳性。

Figure  1.  Positive expression of ANXA1 and S100A16 in glioma tissues(streptavidin-perosidase method, ×200)

下载: 全尺寸图片 幻灯片

表  1  2组ANXA1表达情况比较

Table  1.  Expression of ANXA1 in the two groups

组别	例数	-(例)	+(例)	++(例)	+++(例)	阳性率(%)
胶质瘤组	160	31	35	72	22	80.6(129/160)
正常对照组	160	148	5	5	2	7.5(12/160)
注：2组ANXA1阳性率比较，χ2=173.560，P < 0.001。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

表  2  2组S100A16表达情况比较

Table  2.  Expression of S100A16 in the two groups

组别	例数	-(例)	+(例)	++(例)	+++(例)	阳性率(%)
胶质瘤组	160	22	32	63	43	86.3(138/160)
正常对照组	160	141	10	8	1	10.0(19/160)
注：2组S100A16阳性率比较，χ2=177.075，P < 0.001。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.2   ANXA1和S100A16表达阳性率在不同级别胶质瘤中的差异

ANXA1和S100A16在WHO分级Ⅰ~Ⅳ级胶质瘤中的阳性率差异均无统计学意义(均P＞0.05)，见表 3~4。ANXA1在不包含WHO Ⅰ级的星形细胞来源的肿瘤中的阳性率最高，达到95.0%(76/80)，远比少突胶质细胞瘤中阳性率42.9%(15/35)高，且二者差异有统计学意义(χ²=40.090，P＜0.001)。S100A16在不包含WHO Ⅰ级的星形细胞来源的肿瘤中的阳性率(83.8%，67/80)与在少突胶质细胞瘤中阳性率(88.6%，31/35)比较，差异无统计学意义(χ²=0.449，P=0.503)。

表  3  不同WHO分级胶质瘤组织中ANXA1表达情况比较

Table  3.  Comparison of ANXA1 expression in glioma tissues with different WHO grades

组别	例数	阳性(例)	阴性(例)	阳性率(%)
WHO Ⅰ级	40	31	9	77.5
WHO Ⅱ级	40	32	8	80.0
WHO Ⅲ级	40	32	8	80.0
WHO Ⅳ级	40	34	6	85.0
合计	160	129	31	80.6
注：各组ANXA1阳性率比较，χ2=0.760，P=0.859。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

表  4  不同WHO分级胶质瘤组织中S100A16表达情况比较

Table  4.  Comparison of S100A16 expression in glioma tissues with different WHO grades

组别	例数	阳性(例)	阴性(例)	阳性率(%)
WHO Ⅰ级	40	33	7	82.5
WHO Ⅱ级	40	34	6	85.0
WHO Ⅲ级	40	35	5	87.5
WHO Ⅳ级	40	36	4	90.0
合计	160	138	22	86.3
注：各组S100A16阳性率比较，χ2=1.054，P=0.788。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

2.3   ANXA1和S100A16的表达阳性率在低级别胶质瘤与DNT中的鉴别诊断意义

ANXA1在DNT组与低级别胶质瘤组的阳性率差异有统计学意义(P＜0.05)，DNT组ANXA1阳性率高于低级别胶质瘤组，见表 5。S100A16的阳性率在上述2组中的差异无统计学意义(P＞0.05)，见表 6。

表  5  低级别胶质瘤组与DNT组ANXA1阳性率比较

Table  5.  Comparison of ANXA1 positive rate between low-grade glioma group and DNT group

组别	合计	阳性(例)	阴性(例)	阳性率(%)
低级别胶质瘤组	80	63	17	78.8
DNT组	20	20	0	100.0
合计	100	83	17	83.0
注：2组ANXA1阳性率比较，χ2=5.120，P=0.024。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

表  6  低级别胶质瘤组与DNT组S100A16阳性率比较

Table  6.  Comparison of S100A16 positive rate between low-grade glioma group and DNT group

组别	合计	阳性(例)	阴性(例)	阳性率(%)
低级别胶质瘤组	80	67	13	83.8
DNT组	20	18	2	90.0
合计	100	85	15	85.0
注：2组S100A16阳性率比较，χ2=0.490，P=0.484。

下载: 导出CSV 

| 显示表格

3.   讨论

ANXA1是Annexins超家族中首先发现的一个成员，主要以钙离子依赖的方式与膜磷脂结合, 又称脂皮质素1或调脂蛋白。ANXA1广泛表达于各种组织和器官，例如肺、骨髓、肠道、内皮细胞、单核-巨噬细胞和胶质细胞等, 参与多种细胞的病理生理过程，包括参与宿主免疫系统中糖皮质激素抗炎反应的调节，磷脂酶A2活性的抑制，细胞信号传导，与细胞增殖、凋亡，甚至与肿瘤的发生、发展密切相关。ANXA1参与调控多种肿瘤组织的分化，在不同肿瘤组织中特征性分布和表达水平均有不同。ANXA1在膀胱癌^[5]、胆囊癌^[6]、乳腺癌^[7-8]、食管鳞状细胞癌^[9-10]以及肝细胞癌^[11]的表达有显著改变。在结肠癌、食管和胃交界处的腺癌、肺癌、肝癌、垂体瘤和毛细胞白血病中表达升高, 并且同一肿瘤不同类型中表达也不一样。其异常表达及细胞内定位改变可能与多种恶性肿瘤的分化及转移相关，能够通过调节甲酰肽受体(formyl peptide receptors，FPRs)的活化促进某些肿瘤的发展。ANXA1可能是潜在的新的肿瘤标志物，为肿瘤的早期诊断、治疗及预后提供新的判断方法^[12]。在多种神经系统疾病的病变部位中均可观察到膜联蛋白A1的表达异常，但其在各类神经疾病中的异常表达机制目前仍然不清楚^[13-14]。本研究结果表明ANXA1的表达在胶质瘤与正常脑组织之间差异有统计学意义，可用于胶质瘤的辅助诊断标记，但在不同WHO分级的胶质瘤中表达水平高低差异无统计学意义，表明ANXA1与胶质瘤的发生发展关系尚不明确。在不同组织学类型中，ANXA1在不包含WHO Ⅰ级的星形细胞来源的肿瘤中阳性率最高，少突胶质细胞瘤中的表达最低，表明ANXA1主要与星形细胞的分化和增殖相关。DNT分为单纯型和复杂型，典型的弥漫性星形细胞瘤与单纯型的DNT有比较好分辨的形态学特征，而复杂型DNT由于具有特殊的少突胶质细胞样细胞，与少突胶质细胞瘤鉴别十分困难，两者临床预后及治疗方案完全不同，DNT预后良好，单纯手术切除即可，而胶质瘤则往往需要术后放化疗，因此，两者的鉴别诊断意义重大。本研究表明ANXA1在DNT的表达阳性率更高，与低级别胶质瘤组表达阳性率比较差异有统计学意义，而少突胶质细胞瘤阳性率更低，因而ANXA1可辅助用于复杂型DNT与少突胶质细胞瘤的鉴别诊断，综合临床、影像学检查及相关免疫组化检查可有效鉴别复杂型DNT与少突胶质细胞瘤，有一定的临床辅助诊断价值。

S100蛋白在硫酸铵中100%溶解，故命名为S100，为酸性蛋白，已有21个家族成员，编码基因定位于1q21。S100蛋白家族与肿瘤细胞生长、浸润、转移过程中所发生的基因和分子变化相关，对临床诊治肿瘤有重要作用。其中S100A16是S100家族的一个新成员，其C端由12个氨基酸组成且高度保守，在N端由15个氨基酸组成loop环，这与由14个氨基酸组成的S100传统的EF端不尽相同，缺少谷氨酸盐残基，这一特异性结构可能对于协调钙的位点是非常重要的。目前已知S100A16在许多肿瘤组织中表达上调，表明该基因与肿瘤的进展和转移密切相关^[15-16]。本研究表明S100A16的表达在胶质瘤中与正常脑组织之间差异有统计学意义，胶质瘤组织中S100A16的阳性率更高，但在不同WHO分级的胶质瘤中差异却无统计学意义，在不同组织学类型中差异也无统计学意义；在DNT与低级别胶质瘤组中同样差异无统计学意义，就目前结果而言，尚不能作为辅助标记物用于DNT与低级别胶质瘤的鉴别诊断。